顯色液滴加位置偏差：未滴加到孔底反應(yīng)區(qū)域，而是滴在孔壁上方，導(dǎo)致顯色液與酶標(biāo)物接觸不充分，但部分殘留酶標(biāo)物會隨液體流動集中反應(yīng)，反而局部信號增強；

未充分混勻：添加顯色液后未輕輕震蕩多孔板（或震蕩力度不足），導(dǎo)致孔內(nèi)酶標(biāo)物與顯色液分布不均，部分區(qū)域反應(yīng)過度，整體 OD 值偏高；

顯色液分裝污染：將顯色液分裝到 EP 管時，使用了被酶污染的移液器或容器，導(dǎo)致分裝后顯色液提前激活，加入反應(yīng)孔后快速顯色。

溫濕度波動：顯色時實驗環(huán)境濕度低于 40%，會加速孔內(nèi)液體蒸發(fā)，導(dǎo)致顯色液濃度升高，反應(yīng)速率加快；若環(huán)境溫度驟升（如靠近空調(diào)出風(fēng)口、加熱器），局部溫度超標(biāo)引發(fā)異常顯色；

震動或碰撞：顯色期間移動多孔板、碰撞實驗臺，導(dǎo)致孔內(nèi)液體飛濺，相鄰孔交叉污染（高信號孔污染低信號孔），使部分孔 OD 值假性偏高。

底物未平衡至室溫：低溫儲存的顯色底物（如 TMB）未提前復(fù)溫至室溫（18-25℃），直接加入 37℃孵育后的反應(yīng)孔，溫度驟變會激活部分底物，導(dǎo)致非特異性顯色；

底物開封后未及時使用：顯色底物開封后暴露在空氣中超過 1 小時，氧氣、二氧化碳干擾會導(dǎo)致底物活性變化，加入孔后反應(yīng)強度異常；

不同批次底物混用：將兩批次顯色底物混合使用，批次間濃度、活性差異導(dǎo)致部分孔反應(yīng)過度，數(shù)值偏高。

終止液濃度異常：未按說明書要求配制終止液（如硫酸終止液應(yīng) 0.5mol/L 實際配制成 1mol/L），高濃度終止液可能破壞顯色產(chǎn)物穩(wěn)定性，導(dǎo)致吸光度異常升高；

終止液添加速度不一致：手動加樣時部分孔快速滴加、部分孔緩慢滴加，緩慢滴加的孔中，終止液未及時擴散，酶促反應(yīng)仍持續(xù)數(shù)秒，導(dǎo)致 OD 值偏高；

終止液污染或變質(zhì)：終止液中混入水分（稀釋濃度）、酸霧（如硫酸終止液吸收空氣中水分），或因儲存不當(dāng)導(dǎo)致成分變質(zhì)，無法快速終止酶活性；

終止后未及時檢測：終止反應(yīng)后未在 10-30 分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測，顯色產(chǎn)物（如 TMB 終止后的黃色化合物）會隨時間氧化褪色，但部分試劑盒底物可能出現(xiàn)反跳現(xiàn)象（吸光度回升），導(dǎo)致數(shù)值偏高。

終止后劇烈震蕩：終止反應(yīng)后過度震蕩多孔板，導(dǎo)致孔內(nèi)氣泡產(chǎn)生，氣泡在酶標(biāo)儀檢測時會反射光線，使吸光度讀數(shù)假性偏高；

孔內(nèi)殘留終止液滴：終止液添加后未去除孔壁殘留液滴（如未甩板或用濾紙輕拍），液滴聚集導(dǎo)致局部濃度過高，檢測時信號異常；

交叉污染：終止液加樣槍頭重復(fù)使用，或槍頭接觸已終止反應(yīng)的孔液后再移至其他孔，導(dǎo)致高信號樣本污染低信號樣本。

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