花生根瘤菌

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實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:

1.稱量>溶化→調(diào)pH >)過濾>分裝>加塞>包扎>滅菌>無菌檢查

2.干熱滅菌:裝入待滅菌物品升溫>恒溫>降溫>開箱取物

3.高壓蒸汽滅菌加水>裝物品>加蓋>加熱>排冷空氣+加壓>恒壓>降壓回零》排汽>取物. >無菌檢查

4.過濾除菌:組裝滅菌>連接→壓濾>無菌檢查>清洗滅菌

低溫存法:

公司產(chǎn)品僅用于科研

①簡單保存法,將瓊脂斜面孢子培養(yǎng)物、菌絲懸浮液以及由麩皮、大米、小米等谷物原料制成的孢子培養(yǎng)物置于4℃冰箱保存,保存時間不超過1 ~2個月，若將谷物原料制備的孢子瓶抽真空并在棉塞上浸蠟,以隔絕外界空氣和水汽,保持時間可達(dá)3~ 4個月;②液氮超di溫保存法,將生長穩(wěn)定期懸浮在10%甘油或其他低冰點(diǎn)液體中,密封于安瓿管內(nèi)，然后控制冷卻速度,使安瓿管溫度逐步下降至-35℃時， 即可置于-150 ~-196℃的液氮罐中保存。大多數(shù)微生物如病毒、噬菌體、多種細(xì)菌、放線菌、酵母和原蟲、特別是一些用冷凍干燥法有困難的微生物,都可用此法長期保存。

微生物菌種的培養(yǎng):

花生根瘤菌

1孢子制備

(1)放線菌孢子的制備

一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分,如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機(jī)鹽等。碳源和氮源不要太豐富（碳源約為1%,氮源不超過0.5%),碳源豐富容易造成生理酸性的營養(yǎng)環(huán)境,不利于放線菌孢子的形成，氮源豐富則有利于菌絲繁殖而不利于孢子形成。一般情況下， 干燥和限制營養(yǎng)可直接或間接誘導(dǎo)孢子形成。放線菌斜面的培

養(yǎng)溫度大多數(shù)為28℃,少數(shù)為37 ℃,培養(yǎng)時間為5~ 14天。

(2)霉菌孢子的制備

霉菌的孢子培養(yǎng),一般以大米、 小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。這是由于這些農(nóng)產(chǎn)品中的營養(yǎng)成分較適合霉菌的孢子繁殖，而且這類培養(yǎng)基的表面積較大，可獲得大量的孢子。霉菌的培養(yǎng)-般為25~ 28 ℃,培養(yǎng)時間為4~ 14天。

2種子制備

(1)搖瓶種子制備

搖瓶種子進(jìn)罐,常采用母瓶、子瓶兩級培養(yǎng),有時母瓶種子也可以直接進(jìn)罐。種子培養(yǎng)基要求比較豐富,并易被菌體分解利用，氮源豐富有利于菌絲生長。原則上各種營養(yǎng)成分不宜過濃,子瓶培養(yǎng)基濃度比母瓶略高,更接近種子罐的培養(yǎng)基配方。

(2)種子罐種子制備

種子罐種子制備的工藝過程,因菌種不同而異，一般可分為一級種子、 二級種子和三級種子的制備。孢子(或搖瓶菌絲)被接入到體積較小的種子罐中,經(jīng)培養(yǎng)后形成大量的菌絲，這樣的種子稱為一級種子， 把一級種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為二級發(fā)酵。如果將一級種子接入體積較大的種子罐內(nèi),經(jīng)過培養(yǎng)形成更多的菌絲,這樣制備的種子稱為二級種子，將二級種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵稱為三級發(fā)酵。同樣道理,使用三級種子的發(fā)酵,稱為四級發(fā)酵。

脫水存法:

①沙土保存法,能產(chǎn)孢子的細(xì)菌、放線菌及霉菌可采用此法保存，即將沙和土以3:2比例混合經(jīng)稀酸處理洗凈過篩,裝入小試管內(nèi)裝置高度為1cm滅菌2~ 3次,烘干后即可將在斜面培養(yǎng)基上生長良好的孢子,用無菌蒸餾水2~ 2.5m制成孢子懸液，吸取少許加入沙土管中,經(jīng)真空抽干,外觀呈松散狀態(tài),于4℃冰箱保存,保存期可達(dá)5 ~7年。

②冷凍干燥法,將孢子懸浮液與保護(hù)劑相混合, 放在安瓿管內(nèi)于-20 -30℃的乙醇浴中速凍。然后,在低溫下用真空泵抽干,用干冰使水汽結(jié)凍,熔封安瓿管,于低溫下保存。保存期可達(dá)5~ 10年之久。

③石蠟油封存法,在斜面菌種培養(yǎng)物上,倒上滅菌后的石蠟油,高出斜面1cm,于4℃冰箱或低溫干燥處保存，此法不適用于能利用石蠟油作碳源的微生物，保存期為一年以上。

菌種的具體保存方法

   微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于不活躍或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。

低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個因素而設(shè)計(jì)的。

菌種保藏方法大致可分為以下幾種：

1．傳代培養(yǎng)保藏法又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細(xì)菌用），培養(yǎng)后于4—6℃冰箱內(nèi)保存。

2．覆蓋保藏法是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當(dāng)延長保藏時間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進(jìn)入，以減弱代謝作用。

   載體保藏法是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進(jìn)行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛。

   寄主保藏法用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏。

5．冷凍保藏法可分低溫冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速凍結(jié)（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

冷凍干燥保藏法先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥）。

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